法国Argolight公司推出了一种新型的耐用多维校准载玻片，可帮助载物台重新定位，测量探测器的功能，检验包括照明均匀性，系统的横向和轴向分辨率以及光谱形状，强度和寿命响应等等一系列参数。

荧光显微镜作为“成像工具”而不是“测量工具”出售。所以对于它的标定面临以下两个方面的限制：

• 显微镜的复杂性不允许不同组件一起进行标定
• 缺少用于标定的标准样品或者样片

Argolight使用的技术来源于波尔多大学，专门从事透明材料内部三维（3D）的多尺度（从亚微米到厘米）标记和雕刻稳定荧光对象的处理。玻璃中的不可光漂白的图案理想地实现了荧光显微镜校准的所有需求。以下介绍荧光多维标尺（空间，强度，光谱，寿命）的几个方面，这些标尺适用于宽视场，共聚焦和多光子显微镜或其组件的标定和光路对准。

校准载玻片

上图显示了一个典型的校准载玻片，它由玻璃基板和黄铜支架组成，其尺寸与标准显微镜载玻片相同。玻璃内部嵌入了各种荧光图案（图1B）。每个图案都旨在解决特定的校准问题。基本图案是中空圆柱体（管状），其FWHM（半高全宽）长度可以在4到10μm之间变化，峰峰直径为0.6到2μm，并且FWHM壁厚250至550nm（图1C和1D）。从基本图案出发，可以实现更复杂的线性或圆形几何3D形状。

上图显示了具有不同功能的一系列模式。图2A中所示的目标的圆形几何形状可以检查共聚焦显微镜中的扫描旋转是否会改变或移动图像。这种结构化的图案还可以验证将不同图像重建成一幅图像的准确性。与专用软件相关联使用，也可以测量载物台重新定位。图2B所示的网格允许检查失真的存在，并且可以验证图像重建的准确性。间隔从100nm开始逐渐增加的线对，旨在测量横向分辨率（图2C）。可以在空间上解析的两条线之间的间距的值给出了横向分辨率。图2D中的填充图案可以测量照明均匀性以及场平坦度（图2E）。图2F中的模式拥有两个在不同深度具有特征的“交叉楼梯”状图案，可以验证共聚焦显微镜的光学截面，并在重建图像后观察载物台的漂移。

光谱特征

上图中的校正载波片一个无可争议的优势是其极其广泛的激发和发射光谱。激发光谱在325至650nm（图3A）的范围内，而发射波长在被紫外线（UV）激发到蓝色辐射（图3B）时可见光到NIR（近红外）范围。更重要的是，它是一个连续体，可以进行荧光显微镜的任何光谱校准，尤其是色差研究。图3C至3H示出了用不同的激发波长和不同的发射光谱范围成像的相同图案。

上图A至C显示了16个正方形，它们针对不同的激发波长和波长发出不同的荧光强度。发射光谱范围对应于三种广泛使用的荧光染料：DAPI，GFP和德克萨斯红。在图D中绘制了每个正方形的实测总体荧光强度与正方形数的关系。对于每个激发和发射光谱范围，可以看到可以很好地区分16个荧光强度水平，并且它们遵循线性变化且斜率不同。因此，该图案提供了“荧光强度标尺”，可用于缩放任何荧光强度测量值。这对于研究探测器响应的动态范围和线性范围特别有用。