Bigger and Better Photons: The Road to Great FLIM Results
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翻译 by 谭瓅
摘要：这篇文章试图帮助bh FLIM技术的现有和未来用户从FLIM实验中获得最佳结果。第一部分解释了TCSPC FLIM的原理，并给出了记录的光子分布的效果。它表明，测量寿命的信噪比在优先取决于记录的光子数量。第二部分重点介绍优化光子数，而不增加施加到样品中的光应力。我们讨论了激发功率、采集时间、采集效率、数值孔径、聚焦精度、对准精度和探测器效率的影响。第三部分将重点介绍光子效率。它考虑了TCSPC计时参数、计数背景、像素数、仪器响应函数的影响，以及多指数衰减函数的挑战。最后一部分专门介绍数据分析。本文中的所有结论均通过在实际条件下记录的真实测量数据进行演示。
优质的FLIM图像
图1：BPAE样品的FLIM图像，2048 x 2048像素，衰减函数记录在256个时间通道中。采用bh DCS-120 共聚焦 FLIM 系统，bh SPCImage FLIM 数据分析软件。
是什么造就了一个好的FLIM图像？它应该具有完美的空间分辨率、足够高的像素数、高对比度、低背景噪声，没有失焦模糊，并且它应该以高信噪比显示荧光寿命。如上图所示。有经验的FLIM用户可能会补充说，仅仅记录荧光寿命是不够的，整个衰减函数应该记录在每个像素中。
为什么发表在科学论文中的FLIM图像很少看起来像上面的图像？这实际上没有任何理由。所有要做的就是使用完美对准的光学元件，正确的显微物镜，完美的聚焦，正确的激发和探测波长，正确的探测器以及一点点耐心。对FLIM的信号处理原理的一些理解也可能有所帮助，这些是每个FLIM用户都可以实现的。
本文介绍了获得出色的 FLIM 结果的重要因素，给出的大多数建议都是微不足道的。然而，差之毫厘，失之千里，正是这些琐碎事物的总和，使得完美的FLIM结果区别于平庸的FLIM结果。
第一部分：TCSPC FLIM结果是光子的分布
TCSPC FLIM原理
追求完美FLIM结果的道路始于理解TCSPC FLIM结果是光子的分布，参考文献[1]。记录过程的基本原理如图2所示。
通过高频脉冲激光束扫描样品，探测器探测发射的荧光单光子，并由TCSPC系统测量激光脉冲周期内每个光子的到达时间t。同时，TCSPC系统确定激光束在光子探测时刻的空间坐标x，y。从这些数据中，光子在空间坐标上和时间上的分布被建立起来。这种光子分布是期望的寿命图像：它是x*y像素的数据阵列，每个像素都包含大量连续时间通道中的荧光衰减函数。参见图 2右。记录过程及其各种扩展的详细说明可以在文献[2]中找到。
图2：TCSPC FLIM原理
图3给出了FLIM记录的光子分布的效果。该图显示了 8 个水平 x 128 垂直像素的图像区域。每个像素有256个时间通道，包含该像素的衰减数据。当然，真实的FLIM图像具有更高的像素数。常规FLIM为采用256至1024个时间通道的512 x512像素的格式，并且已经演示过采用256个时间通道的2048 x 2048像素的格式，参考文献[2]。
对于没有经验的用户来说，图3中所示的分布可能看起来非常“嘈杂”：单个像素中的荧光衰减几乎看不见。当然，这些“噪声”不是由探测器或TCSPC电子设备的任何噪声引起的，它只是一种光子统计的效应，噪声如此之高的原因是光子分布在大量的像素和时间通道上。因此，每个像素的光子数都很低，特别是在每个像素中各个时间通道中的光子数更低。那么，如何降低光子分布中的“噪声”呢？唯一的方法是记录更多的光子，见图4。
图3：TCSPC FLIM的光子分布。该图表示 X × Y = 8 × 128 像素的图像区域，每个像素有256个时间通道，每个时间通道都包含荧光衰减周期内连续时间的光子。
图4：与图3所示的光子分布相同，但记录的光子多10倍，信噪比高出3.1倍，单个像素中的荧光衰减曲线清晰突出。
信噪比——SNR
从这些数据中得出的荧光寿命的信噪比是多少？我们从一个简单的实验中获得答案。
根据定义，荧光寿命τ是分子保持在激发态的平均时间。当一个分子发出一个光子时，这意味着它从激发态返回基态。FLIM系统探测单个光子并测量它们相对于激发脉冲的时间t，如图5 a和b。当FLIM系统探测到大量这样的光子时，它们在激发脉冲后到达探测器的平均时间是分子处于激发态的平均时间，即为荧光寿命，见图5 c。虽然FLIM硬件通常不直接计算平均到达时间，但它存在于光子分布中。
图5，a和b：光子的探测和激发后一段时间（t）内光子随时间的分布. c：探测N光子后的光子分布，激发后的平均到达时间<t>是荧光寿命τ. d：到达时间（t）的标准差σt，是荧光寿命τ。平均到达时间的标准差 στ 为 τ /SQRT(N).
平均到达时间的信噪比是多少？单个光子到达时间的标准偏差στ与荧光寿命τ本身相同，这是指数函数的性质。如果我们平均大量（ N 个）光子的到达时间，则结果的标准偏差στ随N的平方根而减小，请参见图5，d。因此，探测到N个光子后的信噪比，即τ除以其标准偏差στ的比值为：
SNRτ = τ / στ = SQRT (N)
这意味着可以获得荧光寿命的标准偏差只是衰减曲线中光子数量的平方根，参考文献[17]，这在几个方面是一个了不起的结果。首先，像素寿命的信噪比与像素强度的信噪比相同，这否定了FLIM比稳态成像需要更多的光子（因此需要更多的采集时间）的普遍观点。其次，信噪比仅取决于N，特别是，不依赖于记录荧光衰减的时间通道数。换句话说，您可以增加时间通道的数量，以提高时间分辨率或减少采样伪影，而不会影响信噪比。第三，由于SNR仅依赖于N，因此提高寿命精度的唯一方法是增加N。这意味着你要么必须减少像素的数量 – 你通常不希望 – 或者记录更多的光子。记录更多光子是获得良好FLIM结果的关键，也是下一部分的主题。
光子分布的一阶矩
如上所述，单指数衰减（或单指数衰减近似）的荧光寿命可以通过计算光子的平均到达时间来获得。如果光子的单个到达时间不可用，则可以通过从完整的光子分布中计算“一阶矩” M1 （参考文献[18]）获得平均到达时间：
上述等式中的时间t，是光子在FLIM系统的观测时间间隔内的时间，而不是从激发脉冲之后的时间。因此，必须减去激发时间（在实践中是IRF的一阶矩）才能得到荧光寿命τ：
τ = M1fluorescence −M1IRF
该方法如图2所示。蓝点是各个时间通道中的光子数，绿色曲线是IRF，红色曲线是通过用IRF卷积指数函数e-t/τ来计算的假设荧光衰减函数。
图6：荧光寿命的一阶矩计算，荧光寿命是荧光的一阶矩和IRF的一阶矩的差值。
一阶矩技术以理想的信噪比提供单指数衰减的时间。但是，它不会提供多指数衰减函数的参数，并且如果记录包含背景计数，或只有一部分衰减函数位于TCSPC系统的观测时间间隔内，则它不会提供正确的衰减时间。因此，它几乎完全被曲线拟合技术所取代。然而，一阶矩技术有其优点：它可在非常低的光子数下可靠地工作，适用于在线FLIM应用中的快速寿命测定，最重要的是，它提供了一种在理想和非理想条件下估计FLIM信噪比的方法。我们将在本文的后面部分使用到此方法。
SQRT（N）关系的实验验证如图7所示。以不同的采集时间扫描染料溶液，以获得每像素包含约200，1600和9000个光子的FLIM图像。典型的衰减曲线如图7的顶行所示。第二行显示了单个像素中荧光寿命的直方图，它是用一阶矩分析获得的，στ 值和σ/τ = SNR 值在直方图中显示。从这些值可以看出，σ/τ确实非常接近于SQRT（N）。图 7 的底行显示了通过 MLE（最大似然估计）拟合获得的寿命直方图。从MLE拟合获得的寿命直方图比从矩分析中获得的直方图要宽一些，而且MLE结果也接近SQRT（N）的理想信噪比。
图 7：SQRT （N） 关系的验证。顶行：来自罗丹明110染料溶液的FLIM数据单个像素的衰减曲线。从左到右：N = 200个光子，N = 1600个光子，N = 9000个光子。第二行：通过一阶矩方法分析获得的寿命直方图。底行：通过 MLE 分析获得的寿命直方图。
光子效率
探测到光子并不一定意味着它有效地有助于寿命测量的准确性。它可能因TCSPC模块中不适宜地选择的计时参数而丢失，其探测时间可能因探测器传输时间的不确定性而受损，或者可能存在来自背景信号的光子给光子分布增加额外的噪声。在所有这些情况下，获得的寿命的SNR都小于理想值SQRT（N）。这种情况可以用“光子效率”E来描述。E的倒数表示与理想系统相比，非理想系统需要多少光子才能达到相同的信噪比。由于SNR与光子数的平方根成比例，光子效率也可以写为
E = (SNRreal / SNRideal)2
光子效率E是“品质因数”的平方，有时用于比较不同寿命测量技术的效率（参考文献[10，16]）。正确配置的TCSPC系统在最佳条件下工作，其光子效率接近1，达到理想的光子效率将是“最大化光子效率”这一部分的主题。
References
1. W. Becker, Advanced time-correlated single-photon counting techniques. Springer, Berlin, Heidelberg, New York,2005
2. W. Becker, The bh TCSPC handbook, 8th edition. Becker & Hickl GmbH (2019), available online on www.becker-hickl.com. Please contact bh for printed copies.
3. SPCImage NG data analysis software. In: W. Becker, The bh TCSPC handbook, 8th edition. Becker & Hickl GmbH(2019)
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